ELISA a Western blot, fungující evergreen nebo přežitek? Existují účinnější alternativy?
Existuje mnoho metod, se kterými se vědec v oblasti life science nesetká. To však neplatí o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) a western blot, které jsou základními technikami používanými v buněčné biologii, proteomice, imunologii a v mnoha dalších oborech. Jedná se o tradiční techniky, které byly vyvinuty v 80. letech minulého století a v průběhu let byly vylepšovány a zdokonalovány. I my přinášíme inovace založené na ELISA a western blot metodách s potenciálem tyto metody nahradit.
Lumit imunoeseje jako náhrada ELISA
Jak již bylo řečeno ELISA je jednou z nejpoužívanějších metod v různých oblastech, nicméně rozhodně se nejedná o dokonalou metodu. Nejpalčivějším problémem ELISA je množství promývacích kroků a s tím spojená časová náročnost techniky. Tuto překážku překonává Lumit imunoesej.
V případě Lumit imunoesejí jsou dvě protilátky chemicky označeny, jedna malou (SMBiT) a druhá velkou (LgBiT) podjednotkou luciferázy NanoLuc®. Tyto dvě podjednotky mají velmi nízkou vzájemnou afinitu a pouze v případě, že se naváží na dva rozdílné epitopy studované molekuly, dochází k jejich komplementaci a obnovení luciferázové aktivity. Luciferáza následně generuje bioluminiscenční záření úměrné množství analytu ve vzorku.
Jak bylo již řečeno, hlavní výhodou Lumit imunoesejí oproti ELISA je jednoduchost a časová úspora. Je ovšem nutné také zmínit, že jsou vysoce citlivé a mají široký dynamický rozsah. Například v případě detekce interleukinů lze měřit koncentrace od 5 do 20 000 pg/ml. Lumit eseje mají také vysokou specifitu.
Příklady užití technologie
Testování inhibitorů mutovaného KRAS genu.
Měření zánětlivého faktoru TNF-α způsobeného kyselinou diglykolovou.
Přehled nejprodávanějších Lumit esejí najdete zde:
| Název | Popis | Katalogové číslo | |
 |
Lumit™ IL-6 Immunoassay | Rychlá bioluminiscenční imunoesej pro detekci IL-6 | W6030 |
 |
Lumit™ TNF-α Immunoassay | Rychlá bioluminiscenční imunoesej pro detekci TNF-α | W6050 |
 |
Lumit™ IL-10 Immunoassay | Rychlá bioluminiscenční imunoesej pro detekci IL-10 | W6070 |
 |
Lumit HMGB1 (Human/Mouse) Immunoassay | Rychlá bioluminiscenční imunoesej pro detekci HMGB-1 | W6110 |
Přehled dalších dostupných Lumit esejí najdete ZDE.
HiBiT technologie jako varianta k tradičnímu western blotu
Časová náročnost je palčivým problémem také v případě western blotů. Několikahodinový protokol blokování membrány a inkubace protilátek lze ovšem nahradit jednoduchým pětiminutovým postupem technologie HiBiT.
Stejně jako v případě Lumit esejí je tato technologie založená na rozdělení luciferázy NanoLuc® na dvě podjednotky. V tomto případě je ovšem malou podjednotkou HiBiT, který má naopak vysokou afinitu k LgBiT, takže rekonstituce luciferázy nastane okamžitě. V první kroku se HiBiT přidá ke zkoumanému proteinu, a to buď tradičním klonováním nebo pomocí CRISPR/Cas9. Po separaci proteinů na SDS-PAGE a jejich přenesením na nitrocelulózovou membránu lze všechny proteiny označené peptidem HiBiT detekovat přidáním reagencie Nano-Glo® HiBiT Blotting Reagent. Detekční činidlo obsahuje LgBiT a také substrát pro kompletní luciferázu. Generovaná luminiscence je přímo úměrná množství studovaného protienu.
Jedná se opět o luminiscenci, tudíž hlavní výhodou je vedle jednoduchosti a časové úspory také vysoká citlivost – lze detekovat proteiny o množství menším než pikogram. Zároveň se eliminuje riziko nespecifické vazby na membránu.
Dostupné fúzní HiBiT vektory
Využití Time-resolved fluorescence k blottování proteinů
Western blot je kvalitativní až semikvantitativní metodou, což může být limit. Zároveň je k detekci potřeba dokumentační systém, který je mnohdy používaný jen pro tuto aplikaci. Obě limitace vyřešila společnost Molecular Devices, která do svých mikrodestičkových readerů SpectraMax iD5 a SpectraMax i3x přidala i možnost detekce western blotů, prostřednictvím technologie ScanLaterTM.
Principem metody je měření TRF (time-resolved fluorescence) europiem značených sekundárních protilátek vázající širokou škálu často užívaných primárních protilátek. Poločas fluorescence chelátů europia se pohybuje v řádu μs, na rozdíl od ns u běžných fluoroforů. To umožňuje měření dlouho poté, co excitační světlo i fluorescence jakéhokoliv jiného fluoroforu ve vzorku vyhasla, což výrazně zvyšuje poměr signál/pozadí, a v důsledku i citlivost a dynamický rozsah testu. Využití TRF také zvyšuje stabilitu signálu. Není tedy nutná detekce bezprostředně po smíchání, naopak je možná detekce i o měsíc později bez ztráty signálu.
Zavěr
Tradiční metody ELISA a Western blot sehrály klíčovou roli v rozvoji molekulární biologie a proteomiky, ale jejich limity, jako je časová náročnost a složitost, stále více zdůrazňují potřebu inovací. Moderní alternativy, jako jsou Lumit imunoeseje a HiBiT technologie, představují významný krok vpřed díky své rychlosti, jednoduchosti a vysoké citlivosti. Tyto nové přístupy umožňují efektivnější analýzy, které mohou výrazně zefektivnit laboratorní práci. S jejich širším využitím lze očekávat posun ve standardech vědeckých metod, čímž mají potenciál postupně nahradit zastaralé techniky a otevřít nové možnosti pro základní i aplikovaný výzkum.
 |
Autor článku: Ing. Vojtěch Andrle |