Hmotnostní spektrometrie a peptidové mapování s East Portem kde jsem
K identifikaci proteinů se používá tzv. metoda peptidového mapování, kdy dochází ke štěpení proteinu, předem určenou proteázou na peptidy. Používají se proteázy, které štěpí specificky, například za konkrétní aminokyselinou. Existuje celá řada proteolytických enzymů s různou specifitou štěpení. V tomto článku vám představíme několik hojně používaných proteáz od firmy Promega.
Trypsin
Nejčastěji využívanou proteázou je trypsin, který štěpí na C-konci lysinu nebo argininu, pokud není sousední aminokyselinou prolin. Promega je tradičním výrobcem trypsinů. Různé typy trypsinů jsou citovány v desetitisících publikací. Všechny typy trypsinů od Promegy mají modifikované postranní řetězce lysinu reduktivní metylací, která výrazně snižuje autoproteolýzu. Dále jsou ošetřeny tosyl-fenylalanyl-chlormethylketonem – inhibitorem chymotrypsinu, s následnou purifikací pomocí afinitní chromatografie. Tímto procesem se eliminuje nespecifické štěpení v roztoku i v gelu na minimum.
Sequencing Grade Modified Trypsin je tradičním trypsinem používaným přes 50 let. Momentálně se jedná o jednu z cenově nejdostupnějších variant MS grade trypsinu na trhu. Trypsin Gold přináší navíc konzistenci ve výsledcích. Každá šarže Trypsinu Gold je totiž testována pomocí MS, aby byla zajištěna maximální reprodukovatelnost štěpení. Nicméně tím nejlepším, co je momentálně na trhu je rekombinantní Trypsin Platinum. Jeho složení je speciálně upraveno tak, že ani po dlouhodobé digesci proteinu v poměru 1:1 (trypsin:protein) není detekována žádná nespecifická proteolytická aktivita. Navíc je Trypsin Platinum chemicky modifikován, tak že vykazuje ještě nižší autoproteolýzu, než konkurenční trypsiny. Šarže Trypsinu Platinum jsou standardizovány stejně jako v případě Trypsin Gold.
Obr. 1 srovnání štěpení konkurenčního trypsinu (A) a trypsinu platinum (B) – protein Panitumumab
Trypsin/Lys-C Mix
Pro zvýšení přesnosti kvantifikace a posílení reproducibility se často trypsin kombinuje s enzymem Lys-C, specificky štěpícím na C-konci Lysinu. Promega takto kombinuje Trypsin Gold a rLys-C (rekombinantní verze Lys-C se zvýšenou odolností vůči močovině). Posílení Trypsinu pomocí Lys-C zajišťuje také dokonalejší štěpení a lépe štěpí proteiny jejichž štěpná místa jsou hůře přístupná. Navíc má mix účinnější digesci v přítomnosti inhibitorů trypsinu jako je protease inhibitor mix nebo guanidium chlorid.
Obr. 2 srovnání štěpení MS grade trypsinem a mixem trypsin/Lys-C
Arg-C Ultra – Novinka!
Enzym Arg-C, který, jak již vyplývá z názvu, štěpí specificky na kyselinovém konci Argininu. Kromě klasického MS grade Arg-C začala Promega nově vyrábět také Arg-C Ultra, který přináší řadu výhod. Štěpení na C-konci lysinů, které často bývá nežádoucí v případě klasického Arg-C, je silně potlačeno, tudíž roste specifita enzymu. Zároveň je daleko odolnější, co se týče pH (aktivní v rozsahu pH 5-9), taky i co do aktivity v přítomnosti močoviny (enzym je aktivní i v přítomnosti 6M močoviny).
Proalanáza
Drtivá většina MS grade proteáz, má svá pH optima v neutrálním, případně alkalickém prostředí. Hojně využívaným enzymem štěpícím v kyselém prostředí je Pepsin, jehož použití je i vzhledem k jeho vysoké autoproteolýze problematické. Proto Promega přišla s novým enzymem – Proalanázou. Jak již z názvu vyplývá, tento enzym štěpí především na C-konci aminokyselin prolinu a alaninu. Proalanáza je aktivní v kyselém pH (1-5,5), přičemž pH optimum je 1,5. Díky tomu je Proalanáza ideální pro charakterizaci proteinů aktivních v kyselém prostředí a dále pak pro analýzu disulfidických můstků, či fosforylací.
Obr. 3 pH optimum proalanázy
Ostatní proteázy
Promega nabízí celou řadu dalších proteáz jako jsou Glu-C, chymotrypsin, elastáza. Tabulku všech dostupných proteáz včetně jejich specifita a pH optima najdete níže.
Obr. 4 Tabulka dostupných proteáz
Proteázy uvedené v článku
| Popis použití | Název | Katalogové číslo | |
 |
Trypsin je serinová proteáza, která specificky štěpí proteiny na C konci postranních řetězců argininu a lysinu a jeho vysoká účinnost a přísná specifita se využívá pro identifikaci proteinů pomocí MS | Sequencing Grade Modified Trypsin | V5111 |
 |
Trypsin je serinová proteáza, která specificky štěpí proteiny na C konci postranních řetězců argininu a lysinu a jeho vysoká účinnost a přísná specifita se využívá pro identifikaci proteinů pomocí MS. Oproti V5111 přináší navíc větší konzistenci ve výsledcích. | Trypsin Gold | V5280 |
 |
Trypsin Platinum je rekombinantní trypsin, který má díky upravenému složení maximální odolnost vůči autoproteolýze a nemá detekovatelnou nespecifickou proteolytickou aktivitu. | Trypsin Platinum | VA9000 |
 |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade je kombinací enzymů Trypsin Gold a rLys-C. Zajišťuje dokonalejší digesci proteinů a nižší procento missed cleavage oproti samotnému trypsinu. | Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | V5071 |
 |
Arg-C Ultra je vysoce specifický enzym, který štěpí peptidy na C-konci Argininu, a to s výrazně vyšší specifitou než jeho klasická verze Arg-C. | Arg-C Ultra | VA1831 |
 |
Arg-C je endopeptidáza (clostripain), která štěpí proteiny na C-konci argininu včetně míst sousedících s prolinem. | Arg-C, Sequencing Grade | V1881 |
 |
ProAlanase je nová endoproteáza izolovaná a purifikovaná z plísně Aspergillus niger určená pro analýzu proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie. Proalanáza ideální pro charakterizaci proteinů aktivních v kyselém prostředí. | ProAlanase | VA2161 |
 |
Pepsin je proteáza, která selektivně štěpí proteiny na C-konci fenylalaninu, leucinu, tyrosinu a tryptofanu. Díky svému optimu v kyselém prostředí je ideální pro použití v analýze proteinů, například pomocí hmotnostní spektrometrie, samostatně nebo v kombinaci s dalšími proteázami. Pepsin představuje klíčový nástroj pro aplikace, kde jiné enzymy s neutrálním nebo alkalickým pH nejsou vhodné. | Pepsin | V1959 |
SpikeTides referenční peptidy pro kvantifikaci proteinů pomocí MS
V poslední době se do popředí dostávají techniky, pomocí kterých lze ať už relativně nebo absolutně kvantifikovat proteiny ve směsi, jako například SRM a MRM. V drtivé většině případů je nutné studovanou směs porovnat s nějakým peptidovým standardem. Pro tyto účely byly využívány na resinu založené syntézy peptidů na pevné fázi, které jsou složité, značně nákladné a neflexibilní. V posledních letech se do popředí derou proteinové standardy SpikeTides L od firmy JPT, které jsou syntetizovány technikou SPOT. SpikeTides peptidy mají na C-konci (případně uprostřed řetězce) lysin nebo arginin značený těžkým isotopem dusíku (15N) a uhlíku (13C). Pro absolutní kvantifikaci proteinu se používají SpikeTides_TQL, která mají na C-konci, kromě těžkého lysinu nebo argininu, také QTag značku, jehož vazbu na peptid štěpí trypsin. SpikeTides peptidy přinášejí nejen jednoduchost a vyšší citlivost, ale také téměř neomezené pokrytí celých proteomů. Zároveň je díky povaze syntézy těchto peptidů sledovat i buněčné regulace prostřednictvím inkorporace posttranslačních modifikací.
Obr. 5 Souhrn dostupných SpikeTides peptidů
Nabízíme kompletní portfolio společnosti JPT. Pro lepší orientaci poskytovaných služeb vám doporučujeme si stáhnout brožury níže nebo nás kontaktovat.
Syntéza peptidů na míru
Peptidy pro imunologii
Peptidy proteomika
Spolupráce výzkum a vývoj
Hmotnostní spektrometrie spolu s peptidovým mapováním představují velmi cenné nástroje pro moderní proteomiku. Umožňují detailní studium a kvantifikaci proteinů na nejvyšší úrovni. Díky našemu partnerství se společnostmi Promega a JPT přinášíme na český trh špičkové produkty, které usnadňují a zefektivňují výzkum v oblasti life sciences.
 |
Autor článku: Ing. Vojtěch Andrle |