1. Úvod
  2. Novinky

Detekujte a kvantifikujte proteiny pomocí HiBiT značky

HiBiT tag

Chcete sledovat osud vašeho vybraného proteinu v buňkách nebo čistě získat informaci o jeho množství bez nutnosti použití protilátek? Pak by pro vás mohla být ideálním řešením peptidová značka HiBiT, která umožňuje jednoduchou jednokrokovou kvantifikaci proteinů uvnitř i na povrchu buňky pomocí bioluminiscence.

HiBiT je malá peptidová značka, která umožňuje detekci a kvantifikaci značených proteinů v různém formátu pomocí bioluminiscence bez nutnosti použití protilátek. Kvantifikovat lze membránové i intracelulární proteiny a sledovat dynamické procesy proteosyntézy, degradace nebo transportu proteinů v reálném čase pomocí jednoduchých jednokrokových esejí. Pojďme si tedy podrobněji tuto technologii popsat.

NanoLuc luciferáza

Pro úplné pochopení HiBiT technologie se musíme trochu vrátit v historii. Americká společnost Promega je již dlouhodobě jedničkou na poli bioluminiscenčních reportérových technologií. Jako první zařadila do svého portfolia technologie založené na světluškové luciferáze a o něco později pak přidali i Renilla luciferázu. V roce 2012 pak na trh uvedli svoji vlastní patentovanou NanoLuc luciferázu, což je enzym původně izolovaný z hlubokomořské krevety Oplophorus gracilirostris. Pomocí proteinového inženýrství se pak podařilo Promeze vytvořit NanoLuc luciferázu, která je charakteristická velmi malou velikostí (19,1 kDa) a spolu s optimalizovaným substrátem furimazinem poskytuje velmi intenzivní luminiscenci (cca stonásobně intenzivnější než u firefly a Renilla luciferáz). Furimazin je navíc permeabilní a může procházet přes membránu buněk. Lze ho tak velmi jednoduše použít i pro live-cell experimenty s živými buňkami.

srovnání luciferáz

NanoBiT a HiBiT technologie

NanoLuc luciferáza se svojí intenzivní luminiscencí pak položila základy pro další odvozené technologie. V roce 2016 Promega vědecké komunitě představila technologii NanoBiT, kdy NanoLuc luciferázu dále rozdělili na dvě podjednotky, které samy o sobě nemají luminiscenční aktivitu, ale pokud rekombinují, začnou opět emitovat bioluminiscenční záření. Větší jednotka je obecně zvaná LgBiT a byla optimalizována tak, aby měla v buňkách maximální stabilitu. Struktura malé podjednotky pak byla navržena tak, aby měla různou afinitu k LgBiT. Z celé knihovny těchto malých podjednotek pak byly vyselektovány dvě jednotky - SmBiT (small bit) a HiBiT (high affinity bit).

SmBiT (small bit) má velmi malou vzájemnou afinitu s LgBiT. Pokud jsou spolu podjednotky v buňce nebo roztoku tak se spontánně neváží a pro obnovu enzymové aktivity k sobě musí být podjednotky přitaženy vnější silou, např. proteinovou interakcí partnerů, na které jsou obě podjednotky navázány. HiBiT má naopak velmi vysokou afinitu k LgBiT a pokud jsou spolu v jedné buňce nebo roztoku, spontánně rekombinují. Díky tomu je HiBiT ideálním kandidátem právě pro kvantifikaci proteinů.

Srovnání luciferáz

Mezi hlavní výhody HiBiT značky patří jeho malá velikost 1,3 kDa a 11 aminokyselin, což minimalizuje vliv na funkci proteinu. Malá velikost také umožňuje snadný knock-in pomocí CRISPR-Cas9 technologie a spolu s vysokou svítivostí NanoLuc umožňuje studium exprese daného proteinu za nativních podmínek exprese, ve velmi širokém rozsahu koncentrací (více než 7 řádů) a také v reálném čase. Detekce probíhá velmi jednoduše. Stačí přidat detekční kit přímo k treatovaným buňkám v mikrotitrační destičce. Nově je také možnost provádět specifický „pull-down“ HiBiT značených proteinů pomocí LgBiT-HaloTag proteinu a HaloLink magnetickými částicemi.

Pokud chcete začít s HiBiT značením, máte na výběr ze dvou možností. První možností je klasické klonování sekvence vašeho proteinu do plazmidu kódujícího HiBiT. Na výběr je několik vektorů, přičemž HiBiT lze připojit na C nebo N-konec, případně N-konec spolu s IL-6 sekrečním peptidem. Následně stačí provést přechodnou transfekci buněk nebo si vytvořit stabilní linii pomocí blasticidinové selekce. Jednotlivé vektory najdete na našem webu zde: HiBiT vektory.

Druhou možností je pak využití CRISPR-Cas9 technologie pro vsunutí přímo do endogenního lokusu. To umožňuje sledování fyziologických hladin exprese pod kontrolou nativních promotorů a epigenetické regulace a také zachovává nativní stechiometrické poměry s interagujícími partnery. Pokud nemáte žádné zkušenosti s CRISPR technologií, rádi vás propojíme přímo s Promegou a pomůžeme vám navrhnout ideální guideRNA pro přesné vsunutí HiBiT na požadované místo. Jako odrazový můstek vám také může posloužit přímo Protokol pro CRISPR-HiBiT značení popisující nejdůležitější kroky pro tvorbu značených linií. Pro transfekci můžete využít klasickou elektroporaci, speciální lipofekční činidla určené pro tuto aplikaci nebo technologii Nucleofector od společnosti Lonza, která umožňuje transfekci DNA přímo do jádra buňky pomocí unikátní kombinace pufrů a speciálního typu elektroporace. Bližší info o této technologii naleznete v našem článku zde.

Způsoby detekce HiBiT značených proteinů

Samotná detekce HiBiT značených proteinů je pak velmi jednoduchá. Stačí přidat detekční kit přímo k buňkám v mikrotitrační destičce a po krátké 4-10min inkubaci změřit bioluminiscenci. Kit obsahuje vždy LgBiT podjednotku a substrát furimazin a v některých případech lytický pufr. V závislosti na tom, jaký protein chcete sledovat je pak možné použít několik esejí:

Příklady využití HiBiT značení

Jak vidíte, možnosti detekce jsou široké. A co lze tedy vlastně pomocí HiBiT měřit? Můžete sledovat prakticky jakýkoliv děj, při kterém dochází k expresi, degradaci nebo traffickingu značeného proteinu vlivem rozličných podmínek. HiBiT tak lze využít např. pro sledování:

  • Běžné exprese proteinů
  • Sekrece proteinů
  • Kvantifikace membránových proteinů a jejich trafficking
  • Virální infekce pomocí HiBiT kódujících virů a virových částic
  • Degradace proteinů pomocí PROTAC molekul
  • A mnoho dalších

HiBiT aplikace

Potřebujete poradit?

Pokud potřebujete poradit nebo konzultovat vaši konkrétní aplikaci, neváhejte kontaktovat našeho aplikačního specialistu Vojtěcha Ledvinu, případně nás kontaktujte na naší obecné adrese eastport@eastport.cz.