Neuron a kardiomyocyt z pohledu jedné buňky i vzájemně komunikující sítě. Přinášíme různé pohledy pro výzkum elektricky aktivních buněk.
V moderní době lze pozorovat vzestup mnohých onemocnění jako jsou neurodegenerativní choroby Parkinson a Alzheimer, ale i srdeční arytmie, schizofrenie, epilepsie, hypertenze, gastrointestinální poruchy, či některé typy rakoviny. Na první pohled se jedná o výčet vzájemně nesouvisejících onemocnění, nicméně podstatu mají stejnou – špatně fungující elektricky aktivní buňky, tedy neurony a (kardio)myocyty. Na mnoho těchto chorob neexistuje preventivní ani kauzální léčba, a proto se v posledních letech celosvětově investuje mnoho prostředků k pochopení a vysvětlení samotných nemocí a jejich příčin. Jenže jak zkoumat elektricky aktivní buňky? Odpověď v oblasti in vitro výzkumu vám ve stručnosti přinášíme v následujících odstavcích.
Single-cell výzkum: Technika patch clamp
Technika patch clamp je užitečný způsob, jak zkoumat akční potenciál a změny v iontovém složení jedné buňky. Velmi zjednodušeným principem metody je nasátí malé části membrány neuronu, či kardiomyocytu skleněnou mikroelektrodou. V případě patch clamp měření z celé buňky je membrána silným sacím pulsem narušena, tak že vnitřek mikroelektrody je spojitě propojen s cytoplazmou a je tedy možné sledovat i malé změny v iontovém složení buňky.
Vzhledem k tomu, že změny napětí v takto sledovaných buňkách jsou velmi malé, je nezbytné mít dobrý zesilovač signálu a samozřejmě převodník z analogového signálu na digitální a dobrý software pro následnou analýzu.
Jedničkou v této oblasti jsou přístroje Axon, Molecular Devices. Univerzálním zesilovačem vhodný zejména pro whole-cell voltage-clamp a high-speed current-clamp je MultiClamp™ 700B. Pro jednokanálové záznamy s excelentním poměrem signál/šum je ideální Axopatch™ 200B. V případě převodníku využívá Digidata 1550B s unikátním HumSilencerem. Software pCLAMP s posíleným editorem protokolů, zajišťující rychlou a přesnou analýzu je jen třešničkou na dortu.
Multicelulární pohled: Microelectrode array systémy
Jak již bylo řečeno, Patch clamp nám přináší spoustu důležitých informací v rámci jedné buňky. Pokud ovšem chceme zkoumat, jak mezi sebou neurony a kardiomyocyty komunikují a jak je signál amplifikován v rámci celé sítě, je třeba Patch clamp doplnit o vhodnější metodu. Takovou metodou je microelectrode array (MEA). MEA přístroje obsahují několik set mikroelektrod, které měří změny napětí odpovídající extracelulární elektrické aktivitě buňky, respektive buněčné kultury. Často citovaným příkladem takovýchto přístrojů v oblasti in vitro jsou Maestro Edge, Maestro Pro a nově i Meastro Volt. V tomto případě jsou mikroelektrody umístěné ve speciálních mikrodestičkách. Přístroj poté signál naměřený mikroelektrodami amplifikuje a převádí do námi lépe pochopitelné podoby tzv. „spikeů“ (signál detekovaný na jedné elektrodě odpovídající akčnímu potenciál jedné buňky) a „burstů“ (signál detekovaný na mnoha elektrodách najednou odpovídající přenosu signálu mezi buňkami). Detailnější vhled do technologie přináší video níže:
Video Axion BioSystems: What is MEA? - Multielectrode Array Assay
Maestro MEA přístroje přinášejí řadu výhod:
- Neinvazivní metoda, bez nutnosti ničit buňky. Aktivita buněk může být detekována několik měsíců na jediné mikrodestičce
- Label-free metoda, kde není potřeba žádné značení neuronů, či kardiomyocytů
- Jednoduchost: Je potřeba pouze základní znalost práce s buněčnými kulturami
- Kontinuální měření buněčné aktivity v reálném čase
- Simultánní měření všech elektrod ve všech jamkách mikrodestičky
- Vlastní nastavení optimální teploty a kontroly CO2 a O2 bez nutnosti umístění do inkubátoru
- Možnost stimulace buněk prostřednictvím elektrody, která dává pulzy („šoky“)
- Možnost stimulace opticky aktivních buněk světlem o různé intenzitě, barvě a délce záblesku
- Možnost rozšíření o modul na měření impedance, pomocí kterého zjistíme kondici buněk pomocí
- A mnoho dalšího
Často kladené otázky:
Jaký je nejlepší zesilovač pro měření z tkáňových řezů?
Nejvhodnější pro tuto aplikaci je zesilovač MultiClamp 700B. Dodává se se dvěma měřícími hlavami a je ideální pro oba typy nahrávání – voltage-clamp i current-clamp
Je možné automaticky přepínat mezi current-clamp a voltage-clamp v případě MultiClamp 700B zesilovače?
Ano, je to možné. Funkce automatického přepínání režimů v zesilovači MultiClamp 700B umožňuje automatické přepínání mezi current-clamp a voltage-clamp. V softwaru Commander je nutné zaškrtnout políčko přepínání režimů.
Jaké typy kultur nervových buněk lze měřit na přístrojích Maestro MEA?
Jediný požadavek je, aby buňky byly elektricky aktivní. Lze použít primární neurony nebo neurony odvozené z kmenových buněk. Mohou být kokultivovány s gliovými buňkami nebo bez nich. Neurony lze měřit z 2D kultur, organoidů nebo jiných 3D kultur a řezů.
Jaké jsou výhody MEA pro studium Alzheimerovy choroby in vitro?
- Maestro MEA nabízí kontrolované prostředí pro podrobné studium aktivity neuronových sítí in vitro
- Vícejamkové destičky jsou ideální pro high-throughput screening linií a terapeutik specifických pro daného pacienta
- Neinvazivní sledování umožňuje studovat dlouhodobé účinky a progresi onemocnění
- Jednoduchý protokol, který vyžaduje pouze základní techniky kultivace buněk pro měření nervové elektrofyziologie
 |
Autor článku: Ing. Vojtěch Andrle |