Přehled metabolických esejí Promega

Naše nejprodávanější metabolické eseje

V případě že potřebuje pomoci s výběrem nebo lépe porozumět funkci metabolických esejí, doporučujeme si přečíst nejdříve článek níže.

Název produktu	Kód zboží
NAD/NADH-Glo Assay	G9071
NADP/NADPH-Glo Assay	G9081
Lactate-Glo Assay	J5021
Glucose-Glo Assay	J6021
Glutamate-Glo Assay	J7021
Glutamine/Glutamate-Glo Assay	J8021
Glucose Uptake-Glo Assay	J1341

Všechny metabolické eseje v e-shopu zde

 

Aerobní glykolýza a glutaminolýza

Glukóza je klíčovou energetickou molekulou pro většinu buněk. Za normálního stavu je metabolizována na acetyl-CoA, který vstupuje do citrátového cyklu a následně je generována energie v podobě ATP skrze oxidativní fosforylaci. V době růstu a proliferace zvyšují buňky svůj příjem glukózy, metabolizují ji primárně glykolýzou s tvorbou laktátu a vznikající meziprodukty jsou odváděny do syntetických drah. Rostoucí buňky také přijímají ve větší míře glutamin, který dodává palivo do citrátového cyklu, aby se udržela produkce ATP. Kromě generování energie může být glutamin konvertován nebo se podílet na syntéze dalších aminokyseliny (glutamát, alanin, aspartát), které jsou potřebné pro syntézu nových proteinů. Navíc je i jedním ze stavebních kamenů glutathionu, který pomáhá kontrolovat hladinu volných radikálů, a koncentrace glutaminu a glutamátu jsou úzce spjaty s koncentrací kyslíkových radikálů. U proliferujících buněk, jako jsou rakovinné nebo imunitní buňky, dochází k metabolickému posunu k tzv. aerobní glykolýze. Ta je charakteristická výrazně vyšším příjmem glukózy a kyslíku a sekrecí laktátu i za aerobních podmínek. U těchto buněk dochází také ke zvýšené glutaminolýze a příjmu glutaminu z důvodu vyšší potřeby energie a aminokyselin pro proteosyntézu. Zvýšená glykolýza a produkce laktátu do okolí je také indikátorem aktivace imunitních buněk, které se musí rychle množit, aby chránily organismus před patogeny.

Obr. 1 Tři základní potřeby dělících se buněk 

Základní princip metabolických esejí

Pokud vás zajímají změny metabolismu v nádorech, u metabolických poruch, diabetu nebo třeba v průběhu embryonálního vývoje, luminiscenční metabolické Glo eseje od firmy Promega vám pomohou získat kvantitativní a opakovatelná data. Pro jejich použití potřebujete pouze pipetu a destičkový reader, který je schopný detekovat luminiscenci (více o našich luminometrech najdete ve článku zde).Všechny eseje jsou založeny na identickém principu, který pro stanovení jednotlivých metabolitů využívá dvě základní reakce (Obr. 2). V první reakci vždy dochází k oxidaci detekovaného metabolitu pomocí metabolit-specifické dehydrogenázy, která přenáší uvolněný proton na molekulu kofaktoru NAD+­ nebo NADP+. V druhé reakci je pak pomocí proprietárního enzymu reduktázy přenes proton z NADH na molekulu proluciferinu a redukovaný luciferin je zpracován modifikovanou firefly luciferázou Ultra-Glo firefly, která generuje bioluminiscenci. Druhou reakci lze využít i pro stanovení samotného NADH a NADPH pomocí NAD/NADH-Glo a NADP/NADPH-Glo esejí.

Obr. 2 Schéma stanovení metabolitů pomocí bioluminiscenčních esejí firmy Promega. Dehydrogenáza specifická pro daný metabolit přenáší z metabolitu proton na oxidovanou molekulu kofaktoru NAD­+. Ve spřažené reakci je pak NADH využito pro přeměnu molekuly proluciferinu na luciferin, který je zpracován modifikovanou firefly luciferázou Ultra-Glo, a genereju se světelné záření.

Díky luminiscenční detekci mají eseje velmi nízké pozadí, široký lineární rozsah (asi 0,1-100 µM) a vysokou citlivost, což umožňuje měřit signály i z velmi malých objemů vzorků. Měření tak lze provádět v několika módech. Při klasickém endpoint měření se detekční reagent přidá přímo k buňkám. Tím dojde k jejich lyzi a uvolnění metabolitů do média. Lze tedy měřit celkovou koncentraci metabolitu uvnitř i vně buněk. Druhou možností je měření koncentrace metabolitu v supernatantu. V tomto případě se vzorkuje malé množství kultivačního média (stačí 2-5 µl) a měření se provede v druhé mikrotitrační destičce. Díky vysoké citlivosti lze takto provádět i kinetické měření sekrece nebo spotřeby metabolitů a lze provádět měření několika metabolitů z jedné jamky najednou (viz Obr. 3). Jediným limitujícím faktorem je v tomto případě objem kultivačního média.

Obr. 3 Příklad experimentu, kdy byla měřena spotřeba glukózy a glutaminu a sekrece laktátu a glutamátu u dvou linií rakoviny vaječníku. Metabolity byly měřeny vzorkováním 2-5 µl média vždy z jedné jamky. OVCAR-3 jako málo invazivní linie vykazovala výrazně nižší spotřebu glutaminu a sekreci glutamátu. Oproti tomu SKOV-3 jakožto vysoce invazivní a rychle proliferující linie vykazovala velmi výraznou glutaminolýzu [1].

Samozřejmostí je i jednoduchý protokol stanovení, na který jste zvyklí u všech Promega esejí. Většina esejí vyžaduje pro stanovení pouze 1-2 pipetovací kroky a detekční činidlo se přidává přímo ke vzorku. Díky tomu jsou vhodné i pro „high-throughput“ screeningové experimenty v 96 a 384-jamkových destičkách. Kromě klasických 2D kultur lze měřit koncentraci i v 3D kulturách, plazmě, séru (může vyžadovat ředění) nebo třeba vzorcích tkání a orgánů, které ale vyžadují předřazený krok homogenizace. Přímo lze sledovat lze celou řadu metabolitů, jak už napovídají názvy jednotlivých kitů – Lactate-Glo, Glucose-Glo, Glutamate-Glo, Glutamine/Glutamate-Glo, BCAA-Glo (pro stanovení leucinu, isoleucinu a valinu).

Stanovení lipidů a glykogenu

Na identickém principu funguje i stanovení biopolymerů, jako jsou triacylglyceroly (TAG) nebo glykogen. V tomto případě je nejprve nutné pomocí předřazené enzymové reakce uvolnit metabolit z biopolymeru a následně se stanoví základní stavební jednotka. V případě TAG je tedy nejprve nutné uvolnění glycerolu z TAG pomocí lipázy a jeho fosforylace pomocí kinázy (Obr. 4). Glycerol-3-fosfát je pak oxidován a detekován shodně jako ostatní metabolity. Takto lze velmi jednoduše měřit např. akumulaci tuků v adipocytech a získat tím další kvantitativní informaci k běžně používanému mikroskopickému barvení nebo analýze pomocí průtokové cytometrie. V případě glykogenu se polysacharid nejprve štěpí na glukózu pomocí glukoamylázy a následně se stanoví glukóza s pomocí příslušné dehydrogenázy.

Obr. 4 Princip stanovení glycerolu a triacylglycerolů pomocí Triglyceride-Glo™ Assay.

Stanovení příjmu glukózy

Poslední esejí, která využívá systém detekce NADH je Glucose Uptake-Glo esej pro měření příjmu glukózy do buněk. Esej využívá pro stanovení 2-deoxyglukózu (2DG), kterou buňky neumí metabolizovat, ale je převáděna do buněk stejnými transportními systémy. Během krátké inkubace je 2DG fosforylována na 2DG-6-fosfát. Následně se přidá stop a neutralizační pufr, které zastaví reakci, lyzují buňky a eliminují veškeré NADPH. V posledním kroku se přidá detekční činidlo, které oxiduje 2DG6P na 6-fosfodeoxyglukonát (6PDG) a detekuje se NADPH uvolněné při této reakci (Obr. 5). Tato esej poskytuje citlivost srovnatelnou s radioaktivním stanovením, ale zároveň je mnohem jednodušší na provedení, protože nevyžaduje promývání ani žádná speciální bezpečnostní opatření v laboratoři.

Obr. 5 Princip stanovení příjmu glukózy pomocí luminiscenční eseje Glucose Uptake-Glo Assay

Závěr

Jak je vidět, metabolické eseje od Promegy pokrývají poměrně široké spektrum metabolických drah a metabolitů, které je možné sledovat. Díky jednoduchému protokolu stanovení je můžete snadno začlenit do vašich experimentů a získat tak nové nebo doplňující informace o metabolismu zkoumaných buněk, tkání a orgánů. A pokud byste se náhodou někdy při měření dostali do úzkých, vždycky můžete využít naši podporu a my se vám budeme snažit maximálně pomoci.

Reference

[1] Leippe, D  et al. (2017), SLAS Discov. 22(4):366-377

 

Potřebuje poradit? Kontaktujte nás!

Aplikační podpora Promega – Ing. Vojtěch Ledvina, Ph.D., vojtech.ledvina@eastport.cz, 725 320 796

Obchodní podpora Promega – Ing. Vojtěch Andrle, vojtech.andrle@eastport.cz, 724 241 350