Tři nastupující trendy v oblasti buněčných esejí.
Testování cytotoxicity, odhalování funkce proteinů, interakcí biomolekul měření buněčné signalizace, metabolizmu, imunitní odpovědi, cílení léčiv a další experimenty všechny závisí na buněčných esejích. U moderních buněčných esejí pozorujeme trendy, které shrnujeme v následujícím krátkém článku. Představíme vám několik nových esejí, jimiž společnost Promega reaguje na vývoj v oboru a aktuální poptávku ze strany zákazníků.
1. Kinetické eseje.
V klasických end point esejích získáme z každé jamky na destičce pouze jedno číslo. To může stačit, ale jen pokud přesně víme, kdy je ten správný moment pro měření parametru, který nás zajímá. Častěji si nejsme jistí, kdy např. testovaná molekula začne působit na buňky toxicky a nebo nás prostě zajímá i kinetika buněčné odpovědi, nejen konečný výsledek.
Pro tyto případy Promega nabízí kinetické verze esejí pro buněčnou viabilitu a apoptózu, které využívají luciferázu s nejlepšími parametry na trhu, NanoLuc. Další esej, LDH-Glo, která měří cytotoxicitu, je také snadno adaptovatelná pro kinetická měření. Postupně se kinetické eseje uvádí na trh již od roku 2015 a ve světě i v Česku si kinetická měření našla spoustu příznivců. V konečném součtu můžou kinetické eseje pro vás znamenat úsporu reagencií, plastu i buněk.
Obr 1. Srovnání kinetických a end point esejí z hlediska spotřeby materiálu a buněk.
Pokud vás kinetické eseje zajímají, tak nás neváhejte kontaktovat. Naši aplikační specialisté vám pomůžou se zavedením metody u vás v laboratoři. Rutinní používání kinetických esejí vyžaduje dobrý přístup k luminometru – možnost ho rezervovat na delší čas. Pokud uvažujete o nákupu vlastního luminometru jen pro vaši výzkumnou skupinu, můžete si přístroj od nás nejprve bezplatně otestovat přímo s vašimi vzorky.
2. 3D eseje.
Klasické 2D kultury imortalizovaných buněk špatně modelují mnoho procesů, které zajímají biomedicínu. Proto se začínají čím dál více prosazovat organoidy, sféroidy, organ on a chip přístupy, apod.
3D buněčné modely vyžadují jinou chemii esejí, např. intenzivnější podmínky pro lýzi, aby se materiál uvolnil skutečně ze všech buněk sféroidu/organoidu. Promega postupně optimalizuje své eseje pro 3D. Již nyní můžete získat upravené verze nejpopulárnějších esejí pro buněčnou viabilitu a apoptózu CellTiter-Glo 3D a Caspase-Glo 3/7 3D.
Obr 2. (A) Srovnání signálu CellTiter-Glo a konkurenční eseje na sféroidech různé velikosti. (B) Průnik fluorescenčního indikátoru buněčné lýze CellTox Green do sféroidů 30 min po inkubaci v eseji.
3. Studium proteinů na jejich přirozené úrovni exprese.
Pokud studujeme proteiny pomocí overexprese, mohou být naše data zatížena řadou artefaktů. Nadbytek proteinu může například způsobit jeho nesprávnou lokalizaci v buňce a narušení tvorby proteinových komplexů. Naštěstí máme již v roce 2021 lepší experimentální metody, které se více blíží přirozené situaci v buňce. Řešením je vložit peptidový nebo proteinový tag pomocí CRISPR-Cas9 přímo do genomu na C- nebo N-konec proteinu našeho zájmu. Takto zachováme přirozenou úroveň exprese Promega nabízí hned dva praktické tagy. Jednak krátký fragment NanoLuc luciferázy HiBiT (jen 11 aminokyselin) a nebo univerzální HaloTag. HaloTag je víceúčelový tag, který lze použít pro purifikaci proteinů, superrezoluční mikroskopii a nově i pro cílenou degradaci proteinů díky technologii PROTAC.
Pokud chcete začít s tagováním endogenních alel pomocí CRISPR, doporučujeme dva webináře ve středu 20. 1. a o týden později 27. 1.
Obr 3. Kinetika degradace proteinu značeného pomocí HaloTag při různých koncentracích HaloPROTAC-3
Rychlý kontakt pro vaše dotazy: Jaroslav Icha, PhD, 725 312 797, jaroslav.icha@eastport.cz
