Exonukleáza III katalyzuje postupné odštěpování mononukleotidů z 3‘-hydroxyl konce dsDNA. Odštěpování začíná na zlomech na DNA, tupých a přesažených koncích a 3‘-vyčnívajících koncích kratších než 4 báze. Produktem jsou pak nukleosid 5‘-fosfáty. Tato 3‘→5‘ exonukleáza také degraduje DNA z 3‘-fosfát konce kvůli svojí vnitřní 3‘-fosfatázové aktivitě. Enzym má navíc apurinovou endonukleázovou aktivitu a H ribonukleázovou aktivitu. Je používán v kombinaci s S1 nukleázou pro jednosměrnou deleci sekvencí z konců DNA fragmentů. Rychlost štěpení lze řídit inkubační teplotou, při zahřátí na 75 °C po dobu 10 minut se enzym zcela inaktivuje. Exonukleáza III je dodávána v koncentraci 150–200 U/µl s 10X reakčním pufrem, který obsahuje 660mM Tris-HCl (pH 8.0 při 25°C) a 6,6mM MgCl2.
