Transfekční činidla Fugene - ověřená účinnost a šetrnost

Transfekce je proces, při kterém se dopravuje cizorodá nukleová kyselina do cytoplazmy nebo jádra eukaryotických buněk. Tato technologie přenosu genů umožňuje studium funkce genů, exprese proteinů, proteinových interakcí a také umožňuje modifikaci genomu pomocí CRISPR-Cas9 aj. V závislosti na konkrétní aplikaci a typu buněk může být transfekce větší či menší výzvou, a proto bylo vyvinuto několik základních metod, jak nukleové kyseliny do buněk dostat při současném zachování jejich viability. Tyto metody se dají rozdělit na tři základní skupiny – virální, chemické a fyzikální. Úhlavními nepřáteli při transfekci jsou obranné mechanismy buněk, které rychle štěpí cizorodou DNA a RNA. V případě, že transfekční metoda přenáší externí nukleovou kyselinu pouze do cytoplazmy (např. lipofekce, elektroporace), závisí úspěch transfekce na tom, jestli proběhne v krátkém časovém intervalu mitóza. Pouze tehdy totiž dochází k rozvolnění jaderné membrány a exogenní DNA má možnost vstoupit do jádra. V opačném případě dochází k rychlé degradaci DNA a neúspěšné transfekci. Tento problém je nejvýraznější u primárních buněk, které se dělí velmi pomalu nebo vůbec (např. neurony). Pokud je metoda schopná doručit DNA přímo do jádra (nukleofekce, virální vektory, mikroinjekce), mitóza pro úspěch není nutná a lze transfekovat i pomalu se dělící a nedělící buňky.

Základní metody transfekce

Pro transfekci živočišných buněk se nejčastěji používá několik základních metod:

• Chemická transfekce – při chemické transfekci dochází ke tvorbě komplexu mezi kationtovým lipidem (transfekční činidlo) a  negativně nabitou nukleovou kyselinou. Tím vzniknout lipidové částice, které pak snadno fúzují s cytoplazmatickou membránou a uvolní nukleovou kyselinu do cytoplazmy. Hlavními výhodami chemické transfekce je její jednoduchost a bezpečnost a nízká imunogenicita. Zároveň je vhodná i pro mnohé typy buněk a je vhodná i pro screeningové aplikace, kdy je potřeba transfekovat velké počty vzorků.
• Biologická virální transfekce – při virální transfekci se transfekovaná nukleová kyselina vsune do virálního vektoru (např. AAV, lentivirus nebo retrovirus) a ten pak přenáší genetický materiál do buněk.Virální vektory umožňují dostat DNA přímo do jádra a provést tak stabilní transfekci nezávislou na buněčném dělení. Při práci s virálními vektory jsou ale vyžadovány vyšší nároky na biologickou bezpečnost.
• Fyzikální transfekce – jak už název napovídá, tyto metody využívají fyzikální síly pro dopravení nukleových kyselin do buněk. Ty mohou být buď přímo vstříknuty do cytoplazmy nebo jádra pomocí tenké kapiláry, případně je možné využít elektrického proudu a vystavit buňky rychlým elektrickým pulzům. Ty vytvoří v membráně póry a DNA proniká do buněk tímto působením. Fyzikální metody jsou vhodné pro mnohé typy buněk a nevyžadují žádné nosiče. Elektroporace nicméně vyžaduje speciální instrumentaci. Zvláštním typem elektroporace je pak technologie Nukleofekce od společnosti Lonza, která kombinuje elektroporaci se speciálními optimalizovanými pufry a je schopna spolehlivě dopravit DNA i přímo do jádra.

V naší nabídce najdete řešení pro celou řadu typů buněk a nabízíme jak transfekční činidla pro chemickou transfekci, tak i speciální elektroporátory Nucleofector od společnosti Lonza. Pokud se chcete o této technologii dozvědět více detailů najdete je v našem článku Nukleofekce: Vstup do světa efektivní transfekce. V tomto článku se dále zaměříme již jen na činidla pro chemickou transfekci od společnosti Promega, která poskytují vynikající účinnost za zachování vysoké viability buněk.

Co zvážit při výběru transfekčního činidla?

Při výběru nejvhodnějšího transfekčního činidla je nutné zvážit několik klíčových bodů:

• Specifita pro daný typ buněk – různé typy buněk reagují na stejnou metodu odlišně, je tedy nutné zvolit činidlo, které poskytuje nejlepší účinnost transfekce pro daný typ.
• Viabilita – vybírejte činidlo, které kromě vysoké účinnosti také zachovává vysokou viabilitu buněk. Účinná transfekce, při které vám ale většina buněk v kultuře pomře, rozhodně není správným řešením.
• Stabilní vs přechodná transfekce – přechodná transfekce je vhodná pro krátkodobé experimenty lze ji provést mnoha metodami a je poměrně rychlá na provedení. Stabilní transfekce je oproti tomu vhodná pro dlouhodobé experimenty a proces generování stabilní linie je výrazně delší, protože je nutné selektovat a expandovat stabilně transfekované klony.
• Počet vzorků – volte metodu podle počtu vzorků, které potřebujete transfekovat. Transfekce chemickými činidly je obecně nejvhodnější pro screeningy s velkým počtem vzorků. Při malém počtu vzorků pak můžeme zvolit fyzikální metody.

Úspěšná transfekce má zásadní vliv na výsledky vašich experimentů. Použití účinných transfekčních činidel s optimalizovaným protokolem je tedy velmi důležité pro získání kvalitních opakovatelných dat. Samotná transfekce ale není to jediné, na co je potřeba při experimentech dát pozor. Mezi důležité parametry patří také:

• Kvalita transfekované DNA – dbejte na vysokou čistotu plazmidové DNA a kvantifikujte koncentraci nukleových kyselin. Použít můžete např. kity Quantifluor v kombinaci s fluorimetrem Quantus.
• Zdravé buňky – udržujte buňky v dobrém stavu s minimálním stresem (pokud se samozřejmě nejedná o záměrný treatment) a čas od času zkontrolujte buňky na přítomnost mykoplazmat, např. pomocí MycoAlert kitu od firmy Lonza.
• Zacházení s reagenciemi – udržujte při práci čistotu, pracujte ve sterilních podmínkách a dodržujte inkubační časy, aby došlo k úplné tvorbě komplexu mezi transfekčním činidlem a nukleovou kyselinou.
• Buněčná biologie – každý typ buněk se chová za stejných podmínek trochu jinak, proto je potřeba počítat i se specifickými biologickými mechanismy, které mohou účinnost transfekce ovlivňovat. Také je dobré sledovat cytotoxický účinek transfekce.

Jak nejlépe hodnotit účinnost transfekčních činidel?

Po samotné transfekci získáte smíšenou kultury, kde jsou zastoupeny úspěšně transfekované viabilní buňky, netransfekované viabilní buňky a poté poškozené umírající buňky. Pro posouzení účinnosti je tedy vhodné použít fluorescenční nebo bioluminiscenční reportér, jako jsou např. fluorescenční proteiny nebo firefly a NanoLuc luciferázy. Čím vyšší bude signál daného reportéru, tím účinnější použitá metoda transfekce. Kromě toho je ale nutné zhodnotit i viabilitu buněk ideálně pomocí komplementární buněčné eseje. Promega nabízí flexibilní řešení pro měření viability, ať už je váš primární výstup jakýkoliv. Pokud používáte fluorescenční proteiny, můžete použít bioluminiscenční esej CellTiter-Glo.V případě, že pracujete s luciferázovými reportéry, můžete viabilitu změřit jednoduše ve stejné jamce pomocí fluorescenční eseje CellTiter-Fluor nebo použít kombinovanou esej ONE-Glo™ + Tox Luciferase Reporter and Cell Viability Assay, která kombinuje CellTiter-Fluor přímo se substrátem pro firefly luciferázu.

Transfekční činidla Fugene - léty prověřená klasika

Promega už mnoho let nabízí kvalitní transfekční činidla řady Fugene, která poskytují vysokou účinnost transfekce a zároveň zachovávají vysokou viabilitu buněk. V nabídce je několik variant s odlišným složením pro transfekci DNA, které jsou vhodné pro různé typy buněk. Novinkou je i Fugene určený pro transfekci siRNA. Další variantou je pak i transfekční činidlo Viafect vyvinuté přímo společností Promega. Níže najdete přehled jednotlivých variant s příklady buněčných linií, pro které jsou nejvhodnější.

Fugene 6 – Spolehlivá rutinní transfekce

Fugene 6 je nejstarší variantou. Jedná se o univerzální šetrné transfekční činidlo pro každodenní transfekci, které poskytuje konzistentní výsledky u celé řady běžně používaných buněčných linií. Obzvláště vhodný je pro:

• COS7
• U2OS
• Raw264.2
• K562

Fugene HD – Pro náročnější linie a pokročilé aplikace

Fugene HD je velmi šetrný k buňkám a zajišťuje vysokou účinnost, aniž by ovlivňoval přirozenou fyziologii vašich buněk. Je určený pro obtížněji transfekovatelné linie, primární a kmenové buňky a je také vhodný pro produkci proteinů a virálních vektorů. Obzvláště vhodný je pro:

• C2C12
• LNCaP
• Jurkat
• HT-29
• MCF7
• PC-12
• H9C2

Fugene 4K – Vysoce účinná transfekce pro rozličné buňky

Fugene 4K je nejnovějším přídavkem do rodiny transfekčních činidel pro transfekci DNA. Oproti klasickému HD má vylepšené složení a poskytuje vyšší účinnost přenosu DNA a šetrnost u klasických linií i u náročnějších primárních buněk. Fugene 4K doporučujeme pro ty případy, kde klasický Fugene 6 nebo HD neposkytuje dobré výsledky. Obzvláště vhodný je pro:

• HCT116
• H1299
• CHO-K1
• A375
• NIH3T3
• HEK293

ViaFect™ – Superior Performance in a Wide Range of Cells

ViaFect je další variantou pro transfekci DNA do náročnějších buněk. Mezi hlavní výhody ViaFectu patří zejména vysoká účinnost a velmi nízká toxicita k buňkám. Zajišťuje tak vysoký stupeň transfekce za zachování zdravých viabilních buněk. Je obzvláště vhodný pro:

• C2C12
• LNCaP
• Jurkat
• HT-29
• MCF7
• PC-12
• H9C2

Fugene SI – šetrná a účinná transfekce dsRNA

Fugene SI je 100% syntetické transfekční činidlo s velmi nízkou toxicitou určené pro transfekci siRNA, miRNA a další malých RNA do široké škály eukaryotických buněk. Je obzvláště vhodný pro výzkumníky, kteří hledají maximální účinnost knockdownu pomocí siRNA s minimální vlivem na buňky.

V případě, že byste chtěli vyzkoušet některá z našich transfekčních činidel, neváhejte nás kontaktovat. U většiny variant jsou dostupná vzorková balení na vyzkoušení, která Vám rádi poskytneme pro prvotní experimenty.

Autor článku: Ing. Vojtěch Ledvina, Ph.D aplikační a produktový specialista molekulární biologie, buněčná biologie, proteomika, spotřební materiál email: vojtech.ledvina@eastport.cz, tel.: 725 320 796