6+1 Tip jak získat nejlepší data z luminiscečních esejí
Článek vás provede důležitými tipy na které je dobré myslet při používání luminiscečních esejí, tak abyste dosáhli nejlepšího možného výsledku a na vaší cestě vás tak nic nepřekvapilo.
Jak získat co nejlepší data z vašich luminiscenčních esejí?
Příprava biologických experimentů je jednoznačně velmi složitou a časově náročnou disciplínou. Hodiny, dny až týdny si pečlivě kultivujete buňky, aby byly v ideální kondici a treatujete je všemožnými reagenciemi s vidinou, že dostanete ukázková data, která konečně potvrdí nebo vyvrátí vaše hypotézy. Když ale konečně vložíte destičku do vašeho readeru, vyleze na vás sled náhodných čísel, která jsou velmi vzdálená od toho, co jste očekávali. Některé biologické aspekty samozřejmě ovlivnit nelze. Příroda je mocná čarodějka a velmi často nedělá přesně to, co od ní očekáváme. Co ale ovlivnit můžeme, jsou technické nedostatky při přípravě vzorků a samotném měření bioluminiscence. Zde si ukážeme, jak se vyvarovat těch nejzákladnějších chyb, abyste zbytečně nevylévali vaše vzorky do odpadu a dostali robustní opakovatelná data.
1) Používejte správné mikrotitrační destičky
Zdá se to jako jasná věc, ale stále se občas objevují lidé, kteří měří bioluminiscenci v průhledné destičce a diví se, že jim vychází zvláštní výsledky. Obecně platí, že čiré destičky jsou vhodné jen pro měření absorbance, kdy nevadí, že dochází k rozptylu záření do sousedních jamek. Měří se pouze záření, které projde vzorkem. Ve viditelné oblasti se používají klasické polystyrenové destičky, pro speciální aplikace v UV oblasti pak kopolymerové COC destičky. Pro fluorescenční měření jsou nejvhodnější černé destičky. Díky černému pigmentu nedochází k vzájemnému ovlivňování jamek a část rozptýleného excitačního záření je pohlcena, což snižuje pozadí měření.
Obr. 1 Kompatibilita jednotlivých typů destiček s detekčními módy
Pro bioluminiscenční stanovení jsou určeny bílé neprůhledné mikrotitrační destičky. V materiálu destiček je přimíchaný TiO2 jako pigment, který brání prostupu světla do okolních jamek a vzájemnému ovlivňování (tzv. crosstalku). Zároveň zvyšuje citlivost tím, že zvyšuje odrazivost povrchu jamek pro emitované záření. Také je potřeba dát pozor na kvalitu destiček. Destičky, které obsahují příliš malé množství bílého pigmentu, mohou propouštět záření a je tedy dobré si je vždy otestovat s pozitivní kontrolou a sledovat, jestli dochází pronikání světla do sousedních jamek. Posledním důležitým faktorem je skladování destiček. Bílé destičky totiž mohou slabě fosforeskovat a přispívat tak opět k pozadí měření. Nejmarkantnější je to, pokud je destička např. vystavena slunečnímu světlu. Ideální je tedy destičky skladovat ve tmě a tomuto jevu se vyvarovat.
Obr. 2 Srovnání bílých destiček od dvou různých výrobců. Do prvního sloupce byla pipetována koncentrační řada luciferázy se substrátem a zbytek destičky byl ponechán prázdný. Při nízkém obsahu pigmentu (TiO2) v destičce (Plate A) může docházet k pronikání bioluminiscence skrz celou destičku a masivnímu ovlivnění dat. U kvalitních destiček (Plate B) k tomut jevu nedochází.
Při měření bioluminiscence v tandemu s fluorescencí pak závisí na intenzitě obou signálů. Obecně se doporučuje prvně vyzkoušet bílou destičku. Pokud má fluorescenční esej příliš vysoké pozadí, je vhodné přejít do černé destičky, kde je tento jev částečně potlačen. Zároveň ale dochází v černé destičce k zeslabení luminiscenčního signálu o jeden až dva řády. Vždy jde tedy o určitý kompromis z hlediska toho, který signál je slabší nebo důležitější.
Pro měření můžete například vyzkoušet námi nabízené destičky od Irish Life Sciences, které jsou dostupné ve všech variantách – čiré, černé, bílé, 96 i 384 jamek. Více se dozvíte zde.
Přehled destiček pro mikrodestičkové readery
2) Jednotné objemy, míchání a bublinky
Ve všech jamkách destičky je nutné pracovat s jednotným objemem vzorku a detekčních esejí. Řiďte se doporučeními výrobce, protože i malé rozdíly v objemu eseje mohou způsobovat velké rozdíly v intenzitě signálu. Po napipetování vzorků a činidel platí stejně jako u jakéhokoliv jiného stanovení pravidlo, že je vzorky nutné před měřením řádně promíchat. V opačném případě může dojít k rozdílům v rychlosti ustálení reakce, k neúplné lyzi buněk (pokud se jedná o lytickou esej), agregaci nebo vysrážení některých složek esejí. Při míchání dejte dobrý pozor na to, aby vám neulpěly kapky činidla na víčku destičky. To může způsobit přesvěcování do sousedních jamek a nepřesnosti při měření. Snažte se také vyvarovat vzniku bublinek při pipetování. Na rozhraní vzduchových bublinek totiž dochází k lomu světla ze vzorku a může se opět částečně snížit signál z dané jamky.
3) Zajistěte konzistentní teplotu a dodržujte inkubační časy
Luminiscenční eseje jsou založeny na enzymatické činnosti luciferáz a dalších pomocných enzymů. Rychlost ustálení signálu je tedy závislá na teplotě a době inkubace enzymu se substrátem. Proto je potřeba při měření zajistit konzistentní teplotu po celé ploše destičky. Při fluktuaci teploty mezi jamkami může docházet k variacím v rychlosti enzymatických reakcích v jednotlivých jamkách. Doba inkubace detekčního činidla se vzorkem je také velmi důležitá. Pokud změříte signál příliš brzy, může být jeho intenzita nižší, protože enzymová reakce ještě nedosáhla ustáleného stavu, a zbytečně tak snižujete citlivost a dynamický rozsah vašeho stanovení. Při příliš dlouhé inkubaci naopak může dojít k saturaci enzymu nebo detektoru příliš vysokým signálem nebo může naopak dojít k poklesu signálu z důvodu vyčerpání luciferázového substrátu.
4) Neporovnávejte signály mezi různými přístroji bez normalizace
Základní jednotkou při měření jsou tzv. relativní světelné jednotky (RLU – relative light units). Jednotlivé přístroje počítají tyto hodnoty různým způsobem. Zároveň mají jednotlivé přístroje i rozdílnou hodnotu pozadí, která je způsobená elektrickým šumem, který se může lišit i u dvou přístrojů stejného modelu. Absolutní hodnoty tedy není možné mezi přístroji porovnávat a pro srovnání je potřeba výsledky normalizovat. U buněčných esejí se nejčastěji normalizuje na počet viabilních buněk, případně se u reportérových esejí kotransfekuje kontrolní plazmid exprimující druhý reportér řízený konstitutivním promotorem (nejčastěji CMV promotor).
5) Na vlnové délce nezáleží
U bioluminiscenčních esejí nemusíte řešit vlnovou délku, ve většině případů to není nutné. Luminiscenční záření je vedlejším produktem enzymatické reakce probíhající přímo ve vzorku. Není tedy nutné filtrovat žádné přicházející ani vycházející světlo jako u fluorescenčních esejí. U multimodálních readerů se jednoduše vyřadí excitační světlo i emisní filtr a sbírá se bioluminiscence v celém rozsahu emitovaných vlnových délek, čímž dosáhneme maximální citlivosti stanovení.
6) Používejte pouze kvalitní eseje
Jednou ze společností, která je předním světovým výrobcem kvalitních luminiscečních esejí je společnost Promega. Produkty této společnosti mají na českém, ale i světovém trhu skvělou pověst a naši zákazníci je spokojeně využívají dlouhé roky. Rádi Vám poskytneme referenci na konkrétní typ eseje nebo pomůžeme přímo s nastavením vaší první aplikace. Níže naleznete tabulku nejpopulárnějších esejí na měření viability, cytotoxicity nebo metabolismu buněk.
Bonusový tip – Nechte přístroj udělat práci za vás
Pokud ještě nemáte vlastní luminometr nebo se váš starý reader pomalu chystá do křemíkového nebe, můžete vyzkoušet luminometry GloMax od americké společnosti Promega. Jedná se o nejcitlivější luminometry a multimode readery na trhu, které disponují nejširším dynamickým rozsahem a nejnižší hodnotou crosstalku. Zároveň mají přednastavené protokoly pro všechny buněčné eseje od Promegy a stačí tedy jen vložit destičku, vybrat metodu a měřit. Přístroje jsou dostupné v několika konfiguracích (možnost kombinace luminometru s měřením absorbance a fluorescence) a můžete si je od nás zdarma zapůjčit na vyzkoušení. Bližší info se dočtete na našem webu.
Článek - Glomax nejcitlivější luminometry na trhu
Máte jakýkoliv dotaz? Kontaktujte nás!
Aplikační a produktový specialista (Promega): Ing. Vojtěch Ledvina, Ph.D., 725 320 796, vojtech.ledvina@eastport.cz
Produktový specialista (Promega): Ing. Vojtěch Andrle, 724 241 350, vojtech.andrle@eastport.cz